基于网络药理学分析和实验验证，SKP通过抑制HIF-1α/HO-1通路减轻糖尿病肾病的铁死亡

基于网络药理学分析和实验验证，SKP通过抑制HIF-1α/HO-1通路减轻糖尿病肾病的铁死亡

背景

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的一种微血管并发症。肾康丸（SKP）是一种中药配方，已广泛应用于DKD的治疗，具有明显的抗氧化作用。铁死亡是一种因铁超载导致的细胞死亡新模式，已被证明与 DKD 相关。然而，SKP 对糖尿病肾病铁死亡的确切作用和潜在机制仍不清楚。

方法

SKP 的活性成分检索自传统中药系统药理学（TCMSP）数据库。使用 Cytoscape 构建蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络和草药成分目标基因网络。利用 Metascape 系统数据库进行基因本体论 (GO) 和京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路富集分析。此外，还建立了链脲佐菌素（STZ）诱导的 DKD 体内模型，以进一步研究和验证 SKP 有效性的可能机制。

结果

我们通过 TCMSP 数据库检索了 56 种化合物并鉴定了 223 个 SKP 靶点。使用 PPI 网络分析确定关键目标。通过构建草药-成分-靶标基因网络，我们分离出了 SKP 中的主要活性成分，这些成分可能对抗糖尿病肾病中的铁死亡。KEGG通路富集分析提示SKP有潜力通过HIF信号通路缓解铁死亡，从而减轻DKD的肾损伤。动物实验中测定空腹血糖、24小时尿蛋白、尿素氮和血清肌酸。结果表明SKP可以改善DKD。动物实验结果也证实了SKP具有减轻DKD小鼠肾纤维化、氧化应激和铁死亡的功效。这些效应伴随着肾组织中 HIF-1α 和 HO-1 蛋白表达的显着降低。mRNA及免疫组化结果同上。

结论

SKP 通过复杂的 HIF-1α/HO-1 信号通路抑制铁死亡，从而可能减轻 DKD 的肾损伤。

介绍

近几年来，全球糖尿病（DM）患病率一直在上升，与此同时，与糖尿病相关的糖尿病肾病（DKD）也逐渐增加[1 ]。DKD是DM的一种严重微血管并发症，临床表现为血糖升高、蛋白尿和肾小球滤过率降低[ 2 ]。值得注意的是，DKD 是终末期肾病（ESRD）的首要原因[ 3 ]。尽管 DKD 的负担不断增加，但临床实践仍面临有效西药可用性的限制。目前，常用血管紧张素II受体阻滞剂或血管紧张素转换酶抑制剂来阻碍肾素-血管紧张素-醛固酮系统，以减缓DKD的进展[ 4 ]。然而，传统的肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂具有明显的副作用，包括高钾血症的风险[ 5 ]。因此，迫切需要确定新的治疗靶点并开发创新药物来应对这一紧迫的医疗保健挑战。

中医药已广泛应用于DKD的防治，疗效显着，不良反应极少[ 6,7 ]。肾康丸（SKP）就是一个例子，它是根据中医原理，专门针对 DKD 量身定制的有效中药配方精制而成的医院处方。SKP由黄芪、杜仲、芡实、益母草、金樱子、玉米须、山楂、鱼腥草组成，多年来在临床得到广泛应用。我们之前使用LC-Q-TOF-MS方法鉴定了SKP中的化合物，并对总多糖、有机酸、总黄酮、总皂苷、总蛋白质进行了定量。SKP的主要类别包括多糖、有机酸、黄酮类、皂苷和嘌呤衍生物等。我们之前的研究也证明了SKP具有减轻db/db小鼠肾损伤和降低蛋白尿的功效[ 8 ]。SKP还具有抗氧化特性。然而，鉴于其复杂的成分，阐明 SKP 对 DKD 治疗作用背后的机制值得进一步探索。

与细胞凋亡、细胞焦亡、自噬等程序性细胞死亡机制不同，铁死亡是一种新的铁依赖性细胞死亡模式[9 , 10 ]。铁死亡的特点是铁介导的活性氧（ROS）对不饱和脂肪酸的氧化，导致脂质过氧化物的产生，导致细胞膜损伤和膜完整性丧失[ 11 , 12 ]。越来越多的证据强调铁死亡在 DKD 发展中的关键作用。ROS是主要来源于线粒体内膜呼吸链的小分子物质[ 13 ]。铁死亡过程会产生大量ROS，而肾小管是线粒体含量最高的组织之一[ 14 ]，更容易发生氧化应激和损伤。先前的研究表明，铁死亡是肾小管细胞死亡的主要模式[ 15 ]，加剧了DKD中的肾小管损伤和间质纤维化[ 16 ]。虽然大多数 DKD 研究传统上集中于肾小球，但肾小管的临床重要性逐渐被认识到。此外，肾小管间质占肾实质质量的90%，这也支持肾小管损伤在DKD进展中发挥重要作用[ 17 ]。

在我们之前的工作中，我们建立了 SKP 在改善 DKD 模型肾小管损伤方面的功效 [8 ]。然而，SKP 发挥治疗作用的具体机制，特别是与铁死亡相关的机制，尚未完全阐明。本介绍为讨论我们的假设奠定了基础，即 SKP 通过抑制铁死亡来减轻肾小管损伤，我们后续的研究采用网络药理学来探索 DKD、SKP 和铁死亡之间的关系，强调多靶点、多成分的治疗方法[ 18] ]。

材料和方法

SKP的材料和剂量设计

SKP由8种中药组成：黄芪、杜仲、芡实、益母草、金樱子、玉米须、山楂、鱼腥草。

本实验室制备SKP如下：黄芪60 g、杜仲15 g、芡实30 g、益母草15 g、金樱子30 g、玉米须30 g、山楂30 g、鱼腥草科达塔 30 克。所有这些草药均来自南方医科大学附属南方医院（中国广州）。将上述药物按相应比例混合，加水(1680mL)煎煮两次，每次1小时，合并上清液。将混合物浓缩至0.91 g/ml和0.455 g/ml并储存于– 20°C以用于动物实验。

试剂

尿蛋白检测试剂盒 (C035-2-1)、尿素检测试剂盒 (C013-2-1)、肌酸酐检测试剂盒 (C011-2-1)、丙二醛 (MDA) 检测试剂盒 (A003-1-2)、还原谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（A006-2-1）、组织铁测定试剂盒（A039-2-1）均购自建成生物工程研究所（中国南京）。二氢乙锭 (S0063) 获自 Beyotime（中国江苏）。链脲佐菌素 (STZ) (S0130-1g) 购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。亚铁离子含量测定试剂盒（BC5415）购自Solarbio（中国北京）。qPCR SYBR Green Master Mix (11198ES08) 购自 Yeasen Biotechnology（中国上海）。GPX4抗体(67763-1-Ig)、GAPDH抗体(60004-1-Ig)和α-SMA抗体(67735-1-Ig)购自Proteintech(中国武汉)。HIF-1α抗体（340462）、HO-1抗体（R24541）和纤连蛋白抗体（250073）购自ZEN-BIOSCIENCE（中国成都）。波形蛋白抗体（AF7013）和β-肌动蛋白抗体（AF7018）购自Affinity Biosciences（中国江苏）。HRP AffiniPure 羊抗鼠 IgG (H+L) (FDM007) 和 HRP AffiniPure 羊抗兔 IgG (H+L) (FDR007) 购自富德生物科技（中国杭州）。

动物和实验设计

研究表明C57BL/6小鼠与人类代谢综合征有许多相似的特征，包括胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受等[19 ]。因此，我们选择C57BL/6小鼠建立DKD模型。4周龄雄性C57BL/6小鼠购自南方医科大学实验动物中心。实验动物饲养在温度（22°C）、照明（12小时光/暗循环）的环境中。允许小鼠自由进食和饮水。

适应性喂养1周后，实验前将小鼠随机分为5组：对照组（n=6）、模型组（n=6）、低剂量SKP组（SKPL）（n=6）、高剂量SKP组（n=6）剂量 SKP 组 (SKPH) (n = 6) 和缬沙坦组 (VAL) (n = 6)。

除对照组外，其余小鼠均采用高脂饮食（HFD）喂养。4周后，连续5天腹腔注射STZ（40 mg/kg，ip，溶于0.1 M柠檬酸盐-柠檬酸钠缓冲液）。对照组仅接受相同剂量的柠檬酸盐-柠檬酸钠缓冲液。注射STZ后，小鼠出现多饮、多食、多尿，体重逐渐下降。3天后测定小鼠空腹血糖（FBG），浓度≥11.1mmol/l作为DKD模型的标准。

制剂总重量为240克，按正常成人（60公斤）计算，成人剂量为每单位体重4克/天。使用 9.1 [ 20 ]的转换系数，这可转换为小鼠剂量为 36.4 g/kg。较低剂量是该量的一半。对于缬沙坦，成人每日剂量为80毫克，相当于1.3毫克/公斤。采用相同的换算，小鼠每日剂量为 11.83 mg/kg。然后，SKPH 组小鼠给予 SKP（36.4 g/kg，ig，每日一次），SKPL 组给予 SKP（18.2 g/kg，ig，每日一次），缬沙坦（11.83 mg/kg，ig，每日一次）。每天），一种阳性对照药物，在 VAL 组中。另外，模型组小鼠给予等体积0.5%CMC-Na溶液处理7周。治疗7周后处死小鼠。然后将组织在液氮中速冻并储存在-80°C直至进行实验。所有实验方案均经南方医科大学机构动物护理和使用委员会批准。（伦理号：L2022047；许可证号：SCXK（粤）2021-0041、SYXK（粤）2021-0167）。

生化分析

用血糖仪测量小鼠尾静脉血中的葡萄糖水平。采用代谢笼收集动物尿液，通过尿蛋白检测试剂盒测定尿蛋白浓度。取上层血清按照检测试剂盒说明书检测血清相关指标。这包括评估血尿素氮 (BUN) 和血清肌酐 (Scr) 的肾功能。

GSH、MDA、ROS、Fe²⁺和铁浓度的评估

将肾组织添加到九倍体积的生理盐水中并收获用于组织均质化。收集各组上清液，采用丙二醛（MDA）测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、组织铁测定试剂盒、亚铁离子含量测定试剂盒检测含量。采用二氢乙锭检测肾组织细胞内ROS水平。

网络药理学分析

SKP中活性成分的筛选

为了鉴定 SKP 中的活性成分，我们访问了传统中药系统药理学数据库。通过TCMSP检索关键词“黄芪”“杜仲”“芡实”“益母草”“金樱子”“玉米须”“山楂”“鱼腥草”检索SKP的化学成分及对应靶点科尔达塔”。我们的选择标准包括口服生物利用度（OB）值≥30％和药物相似性（DL）值≥0.18。

目标集合

为了获得与糖尿病肾病和铁死亡相关的相关靶标，我们利用了 GeneCards 数据库。随后，我们使用 UniProt 数据库（UniProt Consortium，2018）标准化了这些目标的名称。

维恩图和 PPI 网络

筛选 SKP、DKD 和铁死亡的靶点并用维恩图可视化。在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中，节点代表基因、蛋白质或分子，而节点之间的线代表关联。将SKP靶点、DKD靶点和铁死亡靶点进行交集，得到SKP在DKD中诱导铁死亡的靶点。将靶标输入STRING数据库构建PPI网络，并使用Cytoscape（版本3.9.1）对这些数据进行分析，构建可视化的复合靶标网络。

成分-目标-疾病网络

为了可视化 SKP 中每种草药的活性成分与其潜在目标之间的相互作用，将数据导入 Excel，然后用于构建全面的成分-目标-疾病网络。该网络是使用 Cytoscape（版本 3.9.1）创建和可视化的，清晰地展示了这些组件和靶点在疾病背景下如何相互关联。

GO和KEGG富集分析

将SKP、DKD和铁死亡的共享靶点导入Metascape系统数据库进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析包括细胞成分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）。

将KEGG富集分析前20名的结果导入生物信息学网站，并通过信息气泡图呈现数据。使用P<0.05作为阈值来确定统计上显着的结果。

分子对接

从SKP获得的化合物结构均来自PubChem数据库。然后将这些结构转换为三维 (3D) 结构，并使用 Chem 3D 将其能量最小化。用于获取蛋白质的晶体结构。随后使用AutoDucktools1.5.7进行分子对接。

组织学评估

将肾脏固定在 4% 多聚甲醛缓冲液中，乙醇脱水，石蜡包埋，制成 4 µm 切片。为了进行组织学评估，进行苏木精和伊红 (H&E) 以及高碘酸希夫 (PAS) 染色。普鲁士蓝染色用于检测铁沉积水平。此外，采用Masson染色和天狼星红染色来评估肾纤维化的程度。

免疫组织化学

对肾组织切片进行免疫组织化学 (IHC) 以评估 GPX4、HIF-1α 和 HO-1 的表达。对组织切片进行脱蜡、水合并回收抗原。随后，将它们与5%山羊血清、抗GPX4一抗（稀释1:200）、HIF-1α（稀释1:50）、HO-1（稀释1:50）抗体在4℃下孵育过夜。然后，用二抗（稀释1：1000）在37℃下处理1小时。然后将切片用 DAB 染色并用苏木精复染，然后用中性树脂密封。

蛋白质印迹法

使用 RIPA 裂解液缓冲液和 pmsf 从肾组织中提取蛋白质。随后将裂解物以 12,000g离心20 分钟，并使用 BCA 测定法测量蛋白质浓度。在 10-12% SDS-PAGE 凝胶上分离蛋白质等份 (30 µg)，然后转移到 PVDF 膜上。将膜在含有5%脱脂奶的TBST溶液中封闭。然后，将膜与以下稀释度的一抗一起孵育：GPX4（稀释度1：1000）、HIF-1α（稀释度1：1000）、HO-1（稀释度1：1000）、纤连蛋白（稀释度1：1000）、α- SMA（稀释1：1000）、波形蛋白（稀释1：1000）、GAPDH（稀释1：1000）、β-肌动蛋白（稀释1：1000）。印迹在 4°C 下孵育过夜，膜用 HRP AffiniPure Goat 处理。

抗兔 IgG (H+L) 二抗（稀释度 1:10,000）、HRP AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗（稀释度 1:1000）4 °C 2 小时。在该过程的最后步骤中，洗涤后使用增强化学发光试剂检测蛋白质条带的电化学发光信号。使用 ImageJ 软件对蛋白质条带强度进行定量。

实时定量聚合酶链式反应 (qRT-PCR)

最初使用 Trizol 和苯酚-氯仿提取法从肾组织中提取总 RNA。然后进行PCR扩增，最后采用2^−ΔΔCT法对结果进行分析。

统计分析

在统计分析中，我们使用数据值作为平均标准差。P < 0.05 被认为具有统计学意义。使用Student’s t检验分析两组之间的差异，并使用单向方差分析分析两组以上的差异。GraphPad Prism 8 用于数据分析。

结果

SKP对DKD小鼠的治疗作用

为了研究SKP对DKD的治疗作用，建立了糖尿病肾病小鼠模型。从给药开始起每2周动态观察小鼠体重。与对照组相比，DKD、SKPL、SKPH和VAL组小鼠体重有所增加，但无统计学意义。

DKD组的FBG显着增加，然而，SKP和缬沙坦可以降低FBG水平，表明它们在控制与糖尿病肾病相关的高血糖方面的潜力。接下来我们进行了肾功能检查，结果显示DKD组24h尿蛋白水平、尿素氮和血清肌酸显着升高，且具有统计学意义，但在SKP干预治疗后下降。此外，SKPH 组比 SKPL 组有更大的改善。

SKP 可减轻 DKD 小鼠的肾损伤。A适应性喂养1周后，小鼠HFD喂养4周，然后腹腔注射STZ 40 mg/kg/天，连续5 d。造模成功后，各药物组给予口服喂养，模型组（n=6）给予等体积生理盐水。治疗持续了7周。B – G SKP 和 Val 减轻了 DKD 小鼠的肾脏损伤和空腹血糖 (FBG)。B给药过程中各组小鼠体重变化。C FBG 电平。D 24小时尿蛋白。E BUN 水平。F血清肌酐水平。小鼠肾组织的G H&E 染色和 PAS 染色（400 × 放大倍数，条 = 100 µm）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 控制组。与 DKD 组相比，^# P < 0.05、^## P < 0.01 和^{### P < 0.001，} ns无显着性

全尺寸图像

HE染色显示对照组肾小球、肾小管、肾间质形态均在正常范围内。相反，DKD 组出现轻度肾小球基底膜增厚、肾小管空泡变性和肾间质水肿。PAS染色进一步证实DKD组糖原和肾小球基底膜厚度显着增加，这些变化在SKP治疗后有所改善。值得注意的是，与对照组相比，DKD 组的肾脏损害明显，但这些表现在 SKP 干预后有不同程度的减轻。总之，我们的研究结果表明，SKP 治疗不仅可以有效降低 DKD 小鼠模型的空腹血糖水平，还可以显着改善肾脏损伤。这凸显了 SKP 作为治疗糖尿病肾病的治疗剂的潜力，其效果在较高剂量下更加明显。

SKP 减少 DKD 小鼠的纤维化

通过蛋白质印迹技术进行的深入分析提供了令人信服的证据。患有 DKD 的小鼠肾组织中纤维发生相关蛋白 α-SMA、纤连蛋白和波形蛋白的相对表达水平显着升高。然而，值得注意的是，SKP 的施用与这些蛋白质表达水平的降低有关，突显了 SKP 在解决糖尿病肾病引起的分子改变方面的治疗潜力。

SKP 可减轻 DKD 小鼠的肾纤维化。Western blot检测各组肾组织中α-SMA Fibronectin和Vimentin的表达情况。B – D α-SMA、纤连蛋白和波形蛋白的蛋白质印迹结果的定量分析。E、F小鼠肾组织纤维化的定量。小鼠肾组织的G Masson 和天狼星红染色（400 × 放大倍数，条 = 100 µm）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 控制组。与 DKD 组相比，^# P < 0.05、^## P < 0.01 和^{### P < 0.001，} ns无显着性

全尺寸图像

如图2G所示，马森和天狼星红染色广泛用于仔细检查组织内的胶原纤维分布 [ 21 ]。正如通过这些染色技术获得的结果所阐明的，已观察到糖尿病显着加剧小鼠肾组织内的纤维化，强调了这种情况的有害影响。

分布统计产生了富有洞察力的数据，揭示了不同剂量的 SKP 治疗具有减轻肾纤维化面积的能力，证明了给药剂量和观察到的减少程度之间的相关性。

SKP对DKD小鼠肾脏铁死亡的影响

为了评估SKP是否可以减轻DKD引起的肾铁死亡，我们对GSH、MDA水平进行了分析。图中描绘的结果显示，与对照组相比，DKD 小鼠中脂质过氧化产物 MDA 显着增加。相反，DKD组的GSH含量显着降低。SKP干预后，DKD小鼠的上述指标均出现不同程度的改善。

图3

SKP 可减少 DKD 小鼠肾组织的铁死亡。A , B小鼠肾组织中MDA（丙二醛）和GSH（谷胱甘肽）的水平。C各组肾脏中GPX4 mRNA水平。D GPX4免疫组织化学染色定量分析。E肾组织中 GPX4 的免疫组织化学染色分析。（400 × 放大倍数，条 = 100 µm）。F , G各组肾组织中GPX4的Western blot检测及GPX4 Western blotting结果的定量分析。H肾组织中铁含量的水平。与对照组相比，*P < 0.05、**P < 0.01 和 ***P < 0.001。与 DKD 组相比，^# P < 0.05、^## P < 0.01 和^{### P < 0.001，} ns无显着性

全尺寸图像

GPX4 被确定为铁死亡的关键调节因子。值得注意的是，SKP 处理导致 GPX4 mRNA 表达显着上调。结果与IHC趋势一致。使用Image J进行免疫组织化学染色的定量分析。我们观察到与正常小鼠相比，DKD 小鼠中GPX4 蛋白减少，SKP 治疗可缓解这一现象。DKD小鼠的铁含量水平显着增加。

网络药理学分析

疾病目标

去除数据库中的重复项后，共获得223个活性SKP化合物、3421个DKD靶点和721个铁死亡靶点。将这三个目标合并起来，总共得到32个共同目标。维恩图用于直观地表示成分和疾病之间的重叠目标。

网络药理学分析。A草药成分目标基因网络。绿色圆圈节点代表 SKP 中的草药，矩形代表 SKP 中的化合物，蓝色六边形节点代表相交目标。A1至H1代表SKP中两种或多种草药的共有成分，详细信息列于附加文件1：表S1。假定目标的B蛋白-蛋白相互作用 (PPI) 网络。中间的红色圆圈节点代表度数最高的八个目标。SKP、DKD 和铁死亡靶标的C维恩图

全尺寸图像

PPI网络和草药成分目标基因网络的构建

随后，我们构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网和草药成分目标基因网络。将 32 个目标导入 STRING 数据库以构建 PPI 网络。将 SKP 活性成分和目标联系起来以阐明它们的相互作用。使用Cytoscape3.9.1软件将结果可视化。值得注意的是，按程度值确定的前 8 个重要靶标包括 TP53、IL6、EGFR、CTNNB1、ESR1、JUN、MYC 和 HIF1A。同时利用Cytoscape3.9.1构建Herb-ingredient-targets基因网络。在活性化合物中，含量最高的是槲皮素、山奈酚、异鼠李素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇和β-胡萝卜素。这些成分被认为是SKP治疗DKD铁死亡的主要活性成分。

表1 PPI网络中SKP治疗DKD的前8个核心靶标汇总

全尺寸桌子

GO和KEGG分析结果

为了研究 SKP 在 DKD 背景下减轻铁死亡的治疗潜力，使用 Matescape 进行了 GO 和 KEGG 通路富集分析。GO富集分析分为BP、CC和MF。主要的BP术语涉及细胞凋亡信号通路的调节、细胞对氮化合物的反应和对无机物质的反应。主要的 CC 术语涉及膜筏、转录调节复合物和细胞投射膜。RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合和泛素蛋白连接酶包含在MF结合中。对于KEGG富集分析，我们的结果表明靶基因主要与癌症通路和HIF信号通路相关。这些见解为 SKP 对 DKD 铁死亡的潜在治疗作用的分子机制提供了有价值的信息。

GO 和 KEGG 富集分析图。A – D点的颜色代表 – log10 (Pvalue) 值，大小代表基因计数

全尺寸图像

分子对接

如图6所示，采用前8个重要靶点（TP53、IL6、EGFR、CTNNB1、ESR1、JUN、MYC和HIF1A）与SKP主要活性化合物进行分子对接，结果以热图形式可视化。小于-7.0 kcal/mol 的亲和力表明具有高结合能力[ 22 ]。结果表明HIF-1α与活性成分结合良好。

主要组件和目标之间的绑定热图。颜色越深，粘合性越好

全尺寸图像

SKP 抑制 HIF-1α/HO-1 信号通路

基于网络药理学，我们推测SKP治疗DKD的机制与HIF-1α/HO-1信号通路密切相关。为了评估该途径中关键蛋白的表达水平，进行了蛋白质印迹分析。结果显示，与模型组相比，SKP治疗显着降低了HIF-1α和HO-1的蛋白表达水平。这些结果与 mRNA 表达一致。

SKP 抑制 HIF-1α/HO-1 信号通路。A ~ D各组肾组织中 HIF-1α 和 HO-1 的 Western blotting 及 HIF-1α 和 HO-1 Western blotting 结果的定量分析。E、F各组肾组织中HIF-1α、HO-1 mRNA水平。G小鼠肾脏中 ROS 变化的代表性图片（条 = 50 µm）。H图像J的 ROS 荧光强度。肾脏中 HIF-1α 和 HO-1 的I – K免疫组织化学染色分析及其表达定量。（400 × 放大倍数，条 = 100 µm）。L小鼠肾组织的普鲁士蓝染色。（800×放大倍数，条= 50 µm）。M小鼠肾组织中亚铁离子含量。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 控制组。与 DKD 组相比，^# P < 0.05、^## P < 0.01 和^{### P < 0.001，} ns无显着性

全尺寸图像

我们研究了小鼠肾组织中 ROS 的表达。与对照组相比，模型组的 ROS 水平升高，然而，在 SKP 治疗后，观察到 ROS 产生显着减少。IHC 证明，与 DKD 小鼠相比，SKP 降低了 HIF-1α 和 HO-1 水平。普鲁士蓝染色显示DKD小鼠的肾小管发生铁死亡。DKD小鼠肾组织中亚铁离子含量明显高于正常组。这些发现共同表明 SKP 有潜力通过抑制 HIF-1α/HO-1 信号通路来减轻铁死亡引起的肾损伤。

讨论

SKP 在 DKD 中的确切机制仍不完全清楚。采用腹腔注射STZ联合HFD诱导DKD动物模型。许多研究表明HFD联合STZ更容易诱发DKD[23 , 24 ]。我们通过24小时尿蛋白水平、尿素氮和血清肌酸等关键指标来评估肾功能。HE和PAS病理染色证明SKP对DKD小鼠的肾损伤有显着改善，肾小管扩张、空泡变性和轻度肾小球基底膜增厚得到缓解。肾纤维化是DKD进展的主要途径，并可能导致ESRD。过多的ROS产生会引发氧化应激并加速纤维化进展[ 25 , 26 ]。同时，已经证明铁死亡可能与纤维化有关[ 27 ]。我们发现SKP可以显着降低DKD小鼠肾组织中α-SMA、纤连蛋白和波形蛋白的表达。马森和天狼星红染色也证实了这一点。

在之前的研究中，我们发现SKP可以减轻DKD的氧化应激，表现为MDA水平显着降低以及抗氧化酶过氧化氢酶和GSH的活性增加[28 ]。鉴于铁死亡和氧化应激之间的密切关联，我们在早期的实验结果的基础上探索了“SKP 可以减轻 DKD 中的铁死亡”的假设。我们的实验提供了支持这一假设的证据。细胞内过多的ROS和铁会引发磷脂的脂质过氧化，导致铁死亡[ 29 ]。GPX4是铁死亡的重要负调节因子[ 30 ]，催化GSH去除ROS，从而保护细胞膜完整性并减少铁死亡[ 31 ]。MDA作为脂质过氧化的最终产物，可作为氧化应激严重程度的指标[ 29 ]。通过检查这些指标，我们发现SKP可以有效降低DKD小鼠肾脏中ROS和MDA水平，并增加GSH和GPX4的表达。另外，GPX4的组织化学结果提示，正常小鼠肾小管中GPX4的表达高于DKD小鼠，经SKP治疗后明显改善。普鲁士蓝染色显示，与正常组相比，DKD小鼠肾小管出现铁沉积。所有这些发现验证了我们关于 SKP 对 DKD 影响的假设，揭示了其作为治疗干预的潜力。

通过网络药理学分析SKP的活性成分和靶点，筛选出SKP与DKD和铁死亡的相互作用靶点：TP53、IL6、EGFR、CTNNB1、ESR1、JUN、MYC、HIF1A、MYC、JUN、PTGS2、CASP8、CAV1、 AR、ERBB2、GSK3B、MDM2、MAPK1、HSPA5、RELA、NFE2L2、HMOX1、HSPB1、RB1、GJA1、GSTP1、BIRC5、PRKCB、DPP4、PCNA、ALOX5、TRPV1、ATP5B、DPEP1。此外，槲皮素、山奈酚、异鼠李素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇和β-胡萝卜素被确定为SKP治疗DKD铁死亡的主要活性成分。其中，槲皮素可以通过抑制铁死亡来减轻急性肾损伤时肾小管细胞死亡和炎症[32 ]。山奈酚被认为具有抗炎和抗氧化作用[ 33 ]，可通过激活Nrf2通路抑制肝细胞铁死亡[ 34 ]。异鼠李素具有抗炎和抗癌作用，还可以降低前额皮质和海马的MDA水平，从而防止氧化[ 35 ]。β-谷甾醇，具有抗氧化和抗炎作用[ 36 ]。木犀草素可通过调节SIRT1/FOXO3通路减轻肾纤维化引起的肾性贫血[ 37 ]。豆甾醇已被证明可以减轻炎症[ 38 ]。此外，β-胡萝卜素在体内和体外研究中都表现出了值得注意的抗衰老能力[ 39 ]。KEGG 富集分析确定 HIF-1 信号通路在 SKP 治疗 DKD 相关铁死亡中发挥着关键作用。分子对接热图结果进一步强调了重要靶点与主要活性成分之间的强大结合活性。根据网络药理学和分子对接分析获得的见解，出现了一个令人信服的假设：SKP 缓解糖尿病肾病铁死亡的作用主要取决于对 HIF-1α/HO-1 信号通路的抑制。这一提出的机制揭示了 SKP 的活性成分、分子靶点和关键途径之间复杂的相互作用，为其治疗糖尿病肾病的治疗潜力提供了全面的视角。

调节因子缺氧诱导因子-1 (HIF-1) 在响应缺氧方面发挥着关键作用，作为包含 α 亚基 (HIF-1α ) 和β亚基 (HIF-1 β ) 的异二聚体转录因子存在[ 40，41 ]。在常氧条件下，HIF-1α触发泛素-蛋白酶体途径引起降解[ 42 ]。然而，在缺氧环境中，HIF-1α 稳定下来，易位到细胞核中，并与 Hif-1 β形成复合物。该复合物与缺氧反应元件位点结合，调节靶基因的表达[ 43 , 44 ]。血红素加氧酶-1 (HO-1) 是 HIF-1α 的下游靶基因 [ 45 ]。它分解血红素，产生胆绿素、亚铁离子、一氧化碳和胆绿素/胆红素等代谢物。HO-1 表达升高会增加 Fe ^{2+ 的}产生，导致 Fenton 反应 [ 46 , 47 ]、ROS 过载并最终诱导铁死亡 [ 48 ]（图 8）。在我们的体内实验中，与正常小鼠相比，DKD 小鼠肾脏中的 HIF-1α 和 HO-1 水平显着较高。观察到 SKP 使 ROS、HIF-1α 和 HO-1 表达减少，表明通过抑制 HIF-1α /HO-1 信号传导可能减弱铁死亡并减轻 DKD。

SKP抗铁死亡改善DKD的研究进展

全尺寸图像

虽然这项研究为 SKP 在 DKD 治疗中的机制提供了有价值的见解，但它并非没有局限性。该研究主要依赖于动物模型，其研究结果需要通过人体临床试验进一步证实。此外，未来的研究应该调查 SKP 在不同类型和阶段的 DKD 中的疗效和长期安全性，以充分确定其治疗潜力。

结论

总之，SKP 具有降低 DKD 小鼠空腹血糖、增强肾功能和减轻肾纤维化的潜力。通过网络药理学分析和体内实验验证，我们首次证明SKP可以通过抑制HIF-1α/HO-1信号传导来缓解铁死亡，从而减少肾脏损伤，这是SKP在治疗中的作用机制之一。DKD 的治疗。

数据和材料的可用性

研究期间的所有数据都可以在本文和附录中找到。

缩写

血压：

生物过程

抄送：

蜂窝组件

知识库：

糖尿病肾病

终末期肾病：

晚期肾脏疾病

光纤光栅：

空腹血糖

去：

基因本体论

GPX4：

谷胱甘肽过氧化物酶4

还原型谷胱甘肽：

谷胱甘肽

HIF-1α：

缺氧诱导因子-1α

HO-1：

血红素加氧酶-1

凯格：

京都基因和基因组百科全书

丙二醛：

丙二醛

中频：

分子功能

生产者价格指数：

蛋白质-蛋白质相互作用

活性氧：

活性氧

SKP：

肾康丸

SKPH：

SKP大剂量

SKPL：

SKP低剂量

链脲佐菌素：

链脲佐菌素

TCMSP：

中药系统药理学

统一保护：

通用蛋白质资源

价值：

缬沙坦